摘要：活体动物光学成像是利用生物发光及荧光技术在活体动物体内进行生物标记通过光学成像系统来监测被标记动物体内分子及细胞等的生物学过程。按发光模式可分为生物发光和荧光两类。相对于传统动物实验研究方法，具有无创、可多次重复、实时活体成像、灵敏、安全等优势，这项技术在标记活体内肿瘤活体细胞示踪、标记基因及转基因动物等方面的应用广泛。
关键词：活体成像；生物发光；荧光；应用
传统实验设计动物研究时，常采用的方法是处死老鼠，解剖后通过肉眼观察脏器病理变化，再组织切片观察等，无法动态监测整个活体内生物学事件的发生、发展，而活体动物光学成像（ optical in vivo imaging） 主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）2种技术在活体动物体内进行生物标记，通过成像系统可以动态或静态监测被标记分子或细胞在活体动物体等的发展进程，以及观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程[1-3]。生物发光是通过荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基因（GFP、RFP及dyes等）进行标记。两者的主要区别在于生物发光是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而荧光则需要外界激发光源的激发出荧光再通过检测器检测，就可以直接观察到被测物体内的细胞运动和基因行为。
1原理与分类
活体动物光学成像技术是指在活体动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达使其产生的荧光素酶蛋白再与小分子底物荧光素作用，需在氧、Mg2+存在的条件下消耗ATP之后发生氧化反应，这时将产生的化学能量转化变为可见光能释放，最后在体外再利用敏感的检测器CCD设备形成图像。荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子（promoter），成为某种基因的报告基因，通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。
1.1生物发光技术 生物发光荧光实质是一种化学发光，其过程需要底物萤火虫荧光素酶的参与，通过氧化其特有底物的过程中，将会释放可见光光子，其波长广泛约为560 nm（460～630 nm），甚至包括超过600 nm的重要的波长红光范围。在哺乳动物体内吸收可见光的主要成分是血红蛋白，能吸收中蓝绿光波段的大部分可见光；吸收红外线主要是水和脂质，但均对波长为590～800 nm的红光至近红外线吸收能力较差，因此波长范围在红光超过600 nm的区域即使有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳动物组织被敏感的CCD检测器检测到。常用方法是构建荧光素酶基因表达载体转染目标细胞，并移植到受体靶器官中，观察时注入外源荧光素，目标细胞内即可发生反应产生荧光，通过活体动物光学成像系统（如IVIS spectrum系统）就可以检测生物发光[4]。生物发光技术因为有着较高的灵敏度，最少可以检测到小动物体内102个细胞此外，还具有对环境变化反应迅速、成像速度快、图像清晰等优点[5]。
1.2荧光成像技术 与生物发光不同，荧光发光不需要底物的参与，但需要外部的激发光源，利用激发光使荧光基团（如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或者荧光染料）达到较高的能量水平，然后发射出波长较长的发射光[6]。荧光成像技术的信号水平取决于发光细胞的数量及激发光的强度，光线穿过的组织对其有强烈的吸收，而且小动物的皮肤、毛发、软骨和体内的食物等都会产生荧光，将会对目标信号产生干扰，因此荧光成像技术的敏感性较生物发光技术差，荧光强度会随着目标深度的增加而成递减。但是荧光成像技术具有标记靶点的多样性、一次可以应用不同的荧光基因标记不同的细胞的优势，因而在进行一些分子生物学以及小分子体内代谢研究中得到了广泛应用[7]。
2成像过程
活体动物光学成像系统一般由高灵敏度的低温CCD相机、成像暗箱和成像软件组成。一般成像过程是：小动物麻醉后放入成像暗箱平台，也可以同时检测多只动物，只需要调整控制平台升降到一个合适的视野，选择合适的条件，对于荧光成像，需要选择合适的滤光片，开启激发光源，激发荧光物质而发光，拍摄出背景图与小动物体内发出的光，将其叠加可以清晰地显示活体内发光情况，完成图像采集。最后可以通过软件对图像进行分析，当选定需要测量的区域后，软件可以计算出此区域发出的光子数，获得实验数据[8]。
3优势
比较目前的活体生物体内成像技术，如超生（ultrasound）、计算机断（Computed Tomography，CT）、核磁共振（Magnetic Tesonance imaging，MRI）、正电子衍射成像（Positron-Emission Tomography，PET）、单光子衍射（Single-Photon-Emission Computed Tomography，SPECT）等技术，活体动物体内光学成像具有许多独特的优势：①无创性，②操作简便，③测量快，④可多个动物同时测量，⑤费用低廉等[9]。它可以检测基因的表达，标记细胞后进行体内示踪，观察药物在体内的治疗效果，使量化变为可能。
4应用研究
4.1抗癌药物标记 信号在抗癌药物研究中，在活体动物体内运用已标记抗癌药物，注射入已接种肿瘤的小鼠体内，观察抗癌药物在不同治疗方式时运用不同剂量观察不同疗程的变化。利用小动物活体成像技术，不仅可以静态观察，也可以通过在不同时间段动态观察癌细胞在体内的变化过程，从而可以观察到抗癌瘤药物的最佳治疗方式、用药剂量、给药时间等。
4.2示踪细胞标记 小动物活体成像技术在示踪细胞应用方面采用了生物发光和荧光两种技术，生物发光对标记少量细胞5000个/视野。近红外荧光对标记细胞数量>300个/视野较敏感。在不同时间点通过示踪细胞对细胞存活状态及分布走向进行观察，有报道可示踪的细胞包括造血干细胞、心肌干细胞、神经干细胞等[10-11]。
4.3细菌与病毒标记 利用细菌荧光素酶基因可以分为标记革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。可以通过标记好的革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌感染活体动物，从而观察动物体内受感染部位的变化，用药物处理后可以观察感染部位细菌数量的变化及受外界刺激后的反应，从而通过系统研究筛选出药物最佳剂量、给药浓度及时间，还可观察记录药物不同剂量对活体的毒副作用。
4.4转基因动物模型标记 通过将靶基因、靶细胞进行荧光素酶标记再将转入活体动物体内，形成所需的各种活体动物转基因模型，包括癌症、免疫缺陷、感染等各种疾病，通过基因治疗，先将基因及其代谢产物高效的、安全的传递到体内靶细胞，再利用生物发光观察目的基因在活体动物体内表达情况，是持续的还是抑制的。目前基因治疗已经是一个热门话题，可用于癌症等多种疾病的综合治疗[12-13]。
4.5药效评价 对于一些需要化学方法进行标记的物质，比如合成药物，肽段及纳米药物等，可通过化学合成的方法与荧光染料进行偶联，或者量子点标记物质，再转入活体动物内，检测荧光的发光情况，从而实现对活体体内药物的追踪，观察药物在活体体内实时表达和药物对体内的准确反应 ，还可用来评估候选药物和其它化合物的毒性 ，为药物在疾病中的作用机制及效用提供研究方法。目前应用较多的是通过腹腔或尾静脉注射一些肿瘤靶向药物，观察其在活体体内对靶点的识别及跟踪药物在体内的分布及代谢情况等[14]。
5前景
活体动物荧光成像技术利用自身优势在不处死动物前提下能够观察到活体动物体内的相关基因表达及其在体内的变化，将从体外分子生物学研究扩展活体小动物体内的变化，已经被大量的科研人员应用到基础医学甚至临床的研究领域。本仪器采用高灵敏度的检测器，使用成本低廉，操作方便，相信在以后的医学、分子生物学等科学研究领域会有相当长的应用空间。
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编辑/肖慧