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摘要：应用喷雾法测定了采自云南省玉溪市新平县新化乡和峨山县岔河乡的烟草蚜虫种群对6种植物源杀虫剂的毒力，并比较了2个烟蚜种群的3种主要解毒代谢酶活力、乙酰胆碱酯酶活力。结果表明，峨山县岔河乡烟蚜对植物源杀虫剂的敏感性高于新平县新化乡的烟蚜，其中0.5%藜芦碱可溶液剂、1.5%苦参碱可溶液剂、0.3%苦参碱水剂、1%苦皮藤素水乳剂、2%除虫菊素水乳剂、除虫菊浸膏对新平县新化乡和峨山县岔河乡烟蚜的毒力比分别为1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037；在高浓度处理下，6种植物源杀虫剂对峨山县岔河乡、新平县新化乡烟蚜的室内盆栽药效存在显著性差异；0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、1.0%苦皮藤素水乳剂、0.3%苦参碱小剂在浓度不低于1125mL/hm2时，可有效防治峨山县岔河乡烟蚜，0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂在浓度不低于2250mL/hm2时，可有效防治新平县新化乡烟蚜；2个地区烟蚜的谷胱甘肽s一转移酶比活力有显著差异，而羧酸酯酶、细胞色素P450单加氧酶、乙酰胆碱酯酶的比活力差异不显著。由结果可知，云南省玉溪市峨山县岔河乡和新平县新化乡烟蚜对6种植物源杀虫剂的敏感性存在显著差异，但羧酸酯酶、P450单加氧酶和乙酰胆碱酯酶3种解毒酶差异不显著，研究结果可为使用植物源杀虫剂防治烟蚜提供科学依据。
关键词：烟蚜；植物源杀虫剂；谷胱甘肽S-转移酶；羧酸酯酶；细胞色素P450单加氧酶；乙酰胆碱酯酶
中图分类号：S435.72 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0137-04
烟蚜（Myzus persicae）别称桃蚜，属同翅目蚜科瘤蚜属，是一种重要的烟草害虫，也是烟草病毒病的传播介体。烟蚜以刺吸式口器吸收烟株叶、茎、花等部位的汁液，使被害烟株生长迟缓、叶片薄，严重时叶片向背面卷缩、变形，烟叶组织被破坏，而且烟蚜分泌蜜露污染烟叶，烘烤后的烟叶缺乏光泽，容易破碎，严重影响产量和品质。化学防治是防治烟蚜的主要措施之一，然而长期使用化学防治，致使烟蚜的抗药性不断增强及再猖獗发生，且使烟叶农药残留增加。因此，低毒、低残留、不易产生抗药性的植物源杀虫剂日益受到了国内外的重视。
植物源杀虫剂是植物与病虫害的长期斗争中产生的具有选择性杀虫、杀菌活性的一系列次生代谢物。植物源杀虫剂具有选择性，且对非靶标生物安全，能维护生态平衡，在自然界中更易降解而使其农药残留的危害降低，对自然环境产生的影响较小。玉溪市是云南省具有悠久历史的烟叶重要产区，也是种植规模最大的地、州、市级烟区之一，对烟草病虫害的防治极为重视。本研究为筛选适于防治烟蚜的植物杀虫剂，并明确峨山县岔河乡和新平县新化乡烟蚜的抗药性及其对不同植物源杀虫剂的敏感性，比较了0.5%藜芦碱可溶液剂、1.5%苦参碱可溶液剂、0.3%苦参碱水剂、1.0%苦皮藤素水乳剂、2.0%除虫菊素水乳剂、除虫菊浸膏6种植物源杀虫剂对玉溪市新平县新化乡和峨山县岔河乡烟蚜的室内毒力及其防治效果，并比较了2个烟区烟蚜解毒酶的比活力，以期对上述烟区使用植物源杀虫剂防治烟蚜提供科学依据。
1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试虫源新平县新化乡烟蚜种群采自云南省玉溪市新平县新化乡大寨常委会的烟株上，峨山县岔河乡烟蚜种群采白玉溪市峨山县岔河乡文山村委会的烟株上，这2个种群分别在室内利用盆栽烟苗进行饲养及扩繁。
1.1.2供试药剂0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、1.0%苦皮藤素水乳剂均由成都新朝阳作物科学有限公司生产；0.3%苦参碱水剂由南通神雨绿色药业有限公司生产；除虫菊素浸膏（乙醇浸出液）由云南省农业科学院农业环境资源研究所提供。
1.1.3试验试剂考马斯亮蓝（；250、细胞色素c、还原型谷胱甘肽，北京索莱宝科技有限公司生产；牛血清白蛋白，云科生物工程公司生产；3，3"，5，5"-四甲基联苯胺、5，5"-二硫代双（2-硝基苯甲酸），阿达玛斯一贝塔公司生产；毒扁豆碱、坚固蓝B盐、1-氯-2，4-二硝基苯，西格玛奥德里奇贸易有限公司生产；乙酸-α-萘酯，海源叶生物科技有限公司生产；碘化硫代乙酰胆碱，CROSORGANICS公司生产。
1.2试验方法
1.2.1室内毒力测定方法以及盆栽药效试验室内毒力测定以及盆栽药效试验均采用喷雾法，在温室内盆栽烟苗，待其生长到4～5张叶片接人烟蚜，让其自然扩繁到一定数量后，进行室内毒力测定试验；每个药剂设置6个浓度，以清水为对照，每个处理设置3个重复，各个重复随机排列，用小型喷雾器对烟蚜虫进行叶面喷雾防治，每个处理的总喷雾量为150mL药液。每株烟苗随机标记3张展开叶，并调查烟蚜数量；施药24h后调查烟蚜活虫数，统计分析其室内毒力、防效。
1.2.2解毒酶比活力测定
1.2.2.1粗酶液制备及酶源蛋白质含量的测定选取50头烟蚜，加0.05mol/L、pH值7.5的Tris-HCl缓冲液1mL，冰浴研浆，离心（4℃，12000r/min）20min，取上清作为工作酶液。蛋白含量测定采用Bradford的方法，用考马斯亮蓝染色，以牛血清蛋白为标准蛋白。
1.2.2.2谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）的测定
谷胱甘肽S-转移酶对1-氯-2，4-二硝基苯的活性测定参照相关文献并改进，每个处理样品各设置3个重复。反应总体积为300mL，先分别加入100μL0.6mmol/LCDNB、100μL6mmol/L谷胱甘肽，混匀后在37℃条件下放置20min；然后加入100μ待测酶液（对照加入0.05mol/L、pH值7.5的Tris-HCl缓冲液）。利用酶标仪于37℃条件测定340nm下5min内吸光度D340nm的变化，每个样品均设置3个重复。
1.2.2.3羧酸酯酶的测定
羧酸酯酶的活性测定参照并改进VanA@eren的方法，用α-萘酚制作标准曲线。每个处理样品各设置3个重复。反应总体积为200mL，先分别加入10μL的0.3mmol/L底物、75μL酶液（对照加入0.04mol/L、pH值7.0的磷酸缓冲液），混匀后在30℃条件下放置10min；然后加入显色剂25μL，利用酶标仪于30℃条件测定600nm处的D600nm值，每个样品均设置3个重复。根据制作的标准曲线和酶原蛋白含量的测定结果，将D600nm值换算成比活力。
1.2.2.4细胞色素P450单加氧酶的测定根据相关参考文献报道的方法并进一步改进，以细胞色素c制作标准曲线。每个处理样品各设置3个重复。反应总体积为325μL，先分别加入200μ的3，3"，5，5"-四甲基联苯胺、80μ磷酸钾缓冲液（0.625mol/L，pH值7.2），然后加入20μL酶液（对照加入0.04mol/L、pH值7.0的磷酸缓冲液），最后加入25μLH2O2，混匀后在室温（25～27℃）放置2h。测定450nm处的D450bnm值，每个样品均设置3个重复。根据制作的标准曲线和酶原蛋白含量的测定结果，将，D450nm值换算成比活力。
1.2.2.5
乙酰胆碱酯酶的测定参考Ellman等的方法并进一步改进。以碘代硫代乙酰胆碱（ATChI）为反应底物、5，5"-二硫代双硝基苯甲酸（DTNB）为显色剂。每个处理样品各设置3个重复，反应总体积为300mL，先分别加入100μL10mmol/L的碘代硫代乙酰胆碱、100μL0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.5）；再加入50μL酶液（对照加入0.1mol/L、pH值为7.5的PBS），混匀后在37℃条件下放置10min；再加入0.125mmol/L的DTNB，于37℃条件测定412nm处10min内的D412nm变化值，每个样品均设置3个重复。
1.3数据统计与分析
上述所有试验数据的统计及方差分析均采用SPSS软件（sPSS17.0）进行，毒力回归式由机率值分析法计算得到，并采用Duncan"s新复极差法和独立样本t检验比较各处理间的差异性。
2.结果与分析
2.16种植物源杀虫剂对烟蚜的室内毒力
采用喷雾法测定了6种植物源杀虫剂对2个烟区烟蚜的室内毒力。结果表明，峨山县岔河乡烟蚜对药剂敏感性高于新平县新化乡烟蚜对药剂敏感性，0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、1.0%苦皮藤素水乳剂、0.3%苦参碱水剂、除虫菊浸膏对峨山县岔河乡烟蚜的半致死浓度（LC50）分别为2.356、6.632、5.640、2.592、1.642、15.053mg/L；6种药剂对新平县新化乡烟蚜的半致死浓度LCso分别为4.288、509.615、11.927、2.736、3.115、482.249mh/L；6种药剂对新平县新化乡烟蚜与峨山县岔河乡烟蚜的毒力比分别为1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037（表1）。峨山县岔河乡和新平县新化乡烟蚜对不同药剂的敏感性存在差异，其中对2%除虫菊素水乳剂、除虫菊浸膏的敏感性差异较大，可能是新平县新化乡使用菊酯类杀虫剂防治而使烟蚜产生耐药性所造成的。
2.26种植物源杀虫剂对2个烟区烟蚜的盆栽药效试验
比较了6种植物源杀虫剂对峨山县岔河乡和新平县新化乡烟蚜药后24h的盆栽药效，防效结果见表2。由表2中结果可知，6种植物源杀虫剂除了除虫菊浸膏外，在4500mL2、2250mL/hm2的处理对峨山县岔河乡烟蚜的防治效果显著高于对新平县新化乡烟蚜的防效（独立样本t检验，P<0.05）。在峨山县岔河乡，0.5%藜芦碱可溶液剂、2%除虫菊素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、1.0%苦皮藤素水乳剂可有效防治烟蚜，其在相同浓度处理下的防效不存在显著性差异（P<0.05，Duncan"s新复极差测验）；而对于新平县新化乡的烟蚜，仅有0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂的防效较高，4500mL/hm2浓度下其他部分药剂的防效存在显著差异。在2个烟区中，O.5%藜芦碱可溶液剂相对于其他药剂具有较好的防效，2.0%除虫菊素水乳剂次之，1.0%苦皮藤素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、0.3%苦参碱水剂、除虫菊浸膏（乙醇浸出液）依次降低。此外，6种植物源杀虫剂除了除虫菊浸膏外，其在1125mL/hm2处理可有效防治峨山县岔河乡烟蚜，与高浓度处理无显著差异；对于新平县新化乡，其药剂浓度大于2250mL/hm2处理的防治才与其他处理存在显著性差异。因此，峨山县岔河乡烟蚜对药剂的敏感性明显高于新平县新化乡烟蚜，0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂、1.0%苦皮藤素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、0.3%苦参碱水剂在不低于1125mL/hm2的条件下可有效防治峨山县岔河乡烟蚜，0.5%藜芦碱可溶液剂、2%除虫菊素水乳剂在不低于2250mL/hmμ2的条件下可有效防治新平县新化乡烟蚜。
2.3峨山县岔河乡、新平县新化乡烟蚜解毒酶活力比较
采用生化法比较了峨山县岔河乡、新平县新化乡烟蚜的谷胱甘肽S-转移酶、羧酸酯酶、细胞色素P450单加氧酶、乙酰胆碱酯酶4种解毒酶的比活力，结果见表3。可以看出，岔河乡、新化乡烟蚜的谷胱甘肽S-转移酶的比活力分别为0.7644、2.0724mmol/（μg·min）；羧酸酯酶的比活力分别为4.8230、6.4444mmol/（μg·min）；细胞色素P450单加氧酶的比活力分别为2.3563、4.0482EU/（μg·min）；乙酰胆碱酯酶的比活力分别为0.0166、0.0136mmol/（min·mg）。峨山县岔河乡与新平县新化乡烟蚜的谷胱甘肽S-转移酶、羧酸酯酶、细胞色素P450单加氧酶、乙酰胆碱酯酶的活力比分别为2.7111、1.3362、1.7180、0.8193。因此，新平县新化乡烟蚜除乙酰胆碱酯酶外其他3种解毒酶比活力均高于峨山县岔河乡烟蚜，但2个地区烟蚜除谷胱甘肽S-转移酶比活力间差异显著，其他3种解毒酶比活力无显著性差异（独立样本t检验）。
3.结论与讨论
本研究应用喷雾法比较了分别采自云南省玉溪市峨山县岔河乡和新平县新化乡的烟蚜种群对6种植物源杀虫剂的毒力和室内防治效果，并比较了2个烟蚜种群的3种解毒酶和1个靶标酶的比活力。结果表明，0.5%藜芦碱可溶液剂、2%除虫菊素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、1%苦皮藤素水乳剂、0.3%苦参碱水剂、除虫菊浸膏对新平县新化乡烟蚜与峨山县岔河乡烟蚜的毒力比分别1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037，即新平县新化乡烟蚜对6种药剂的敏感性低于对峨山县岔河乡烟蚜，其室内毒力高于峨山县岔河乡烟蚜毒力；而在高浓度处理下，室内防效显著低于峨山县岔河乡烟蚜。新平县新化乡烟蚜的谷胱甘肽S-转移酶、羧酸酯酶、细胞色素P450单加氧酶的比活力均高于峨山县岔河乡烟蚜，但羧酸酯酶、细胞色素P450单加氧酶的比活力不存在显著性差异，这可能是峨山县岔河乡、新平县新化乡烟蚜对药剂的耐药性差异不显著所致。
新平县新化乡一直以来主要采用常规化学防治，使得当地的烟蚜种群对防控药剂敏感性下降，室内防控效果下降，解毒酶比活力增加。而峨山县岔河乡的田间烟蚜的施药时间较短且次数较少，对药剂比较敏感。6种植物源杀虫剂中，新平县新化乡烟蚜对2.0%除虫菊素水乳剂和拟除虫菊膏的敏感性最低。0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、1.0%苦皮藤素水乳剂在不低于1125mL/hm2可有效防治峨山县岔河乡烟蚜，其在相同浓度处理下的防效不存在显著性差异。0.5%藜芦碱可溶液剂、2%除虫菊素水乳剂在不低于2250mL/hm2的条件下对新平县新化乡烟蚜的防效较高，与其他药剂存在显著性差异。
综上所述，云南省玉溪市峨山县岔河乡和新平县新化乡烟蚜对0.5%藜芦碱可溶液剂、2%除虫菊素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、1.0%苦皮藤素水乳剂、0.3%苦参碱水剂、除虫菊浸膏6种植物源杀虫剂的敏感性存在不同的差异，除谷胱甘肽S-转移酶的比活力差异显著外，其他3种解毒酶的比活力均无显著差异。0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂、1.0%苦皮藤素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、0.3%苦参碱水剂在不低于1125mL/hm2的条件下可有效防治峨山县岔河乡烟蚜；0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂在不低于2250mL/hm2的条件下可有效防治新平县新化乡烟蚜。本研究结果可为在烟草上使用植物源杀虫剂防治烟蚜提供科学依据。